Idioma: Español
Fecha: Subida: 2020-05-08T00:00:00+02:00
Duración: 19m 26s
Lugar: Espinardo - Facultad de Medicina - Laboratorios
Lugar: Curso
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Determinación de IgA en saliva mediante ELISA II

Soluciones

Transcripción

En este vídeo vamos a explicar las soluciones a las preguntas y cuestiones planteadas en la práctica para la determinación y cuantificación de inmunoglobulinas en la saliva mediante la técnica de Lisa. En la explicación de la introducción, si se decía que la inmunoglobulinas es la mayoritaria en las secreciones y existe una patología que la deficiencia selectiva igea que es un embudo, difícil de primaria, que se explicaba que era la más frecuente, esta es una de las preguntas que se hacían en la práctica, la mayoría de las personas afectadas. Son asintomáticos estas preguntas y bueno, y algunos sí que son afectados, que puede llegar a haber consecuencias graves en alguno de ellos, y las infecciones más recurrentes son el tracto digestivo respiratoria, pues otra posible pregunta en los cuestionarios respecto a la técnica que se comentó en la práctica, que había varios tipos. En concreto, en esta se utilizaron un tipo sandwich directo y se va a venir Igea en saliva en la técnica, y esa es siempre un soporte sólido que se puede unir, o bien el antígeno del anticuerpo en nuestro caso es el anticuerpo anti inmunoglobulinas humana por tanto la capa de captura tenemos la inmunoglobulinas a humana en la capa problema, tenemos nuestras muestras de saliva o bien las muestras, patrón, y, en la capa de detección tenemos el anticuerpo anti inmunoglobulinas humana, unido al enzima a la oxidación Vanesa son selectivamente, aleatoriamente, le habrá tocado algún estudiante alguna de estas tres preguntas? Este es el esquema resumido de el protocolo de realización de la práctica, donde primero se se tapizan con el anticuerpo de captura. Esta sería la capa de captura después de incubar toda la noche y lavar se añade las muestras. Este problema después de encubrir elaborar, se añadiría. La capa de detección, es decir, al anticuerpo con la después. Y se produciría, si apareciera un producto que tiene color, las se mediría y se representaría la concentración respecto a la observancia, pudiendo trazar una recta de calibrado y un rango de sensibilidad sobre el cual podríamos extrapolar los valores de observancia de las muestras problemas y dar un valor. Una de las preguntas que os hacen es cuál es la concentración del anticuerpo de captura. Algunos me habéis dicho 400. Evidentemente 400 es el dial de anticuerpo de captura que os damos, pero no es el la concentración que aparecen los pozos y ahora tenéis que calcular cómo ya pusimos en la introducción. Se utiliza la fórmula de concentración por volumen. Concentración inicial en la que estábamos. El tubo es de 400 microgramos mililitros el volumen que tenéis que añadir; es 38.000 litros; y el volumen finales, 2.476 micrómetros, solamente tienes que aplicar la fórmula de la concentración que sale es seis con 14 microgramos mililitro que esa es la respuesta a la pregunta. A qué concentración de anticuerpos se trabajan en el ensayo para el anticuerpo de detección, es decir, la capa de detección os vuelven a os? Preguntan en este caso el volumen que estamos utilizando entonces aplicando la fórmula; igualmente el volumen final es dos con seis la concentración que queremos preparar, estilo 24.000 mililitros y cómo el vial que proporcionaba majestad acero, ocho microgramos mililitros la única incógnita que tenéis que despejar es cuánto volumen tienes que coger de este tubo para preparar vuestra disolución y la respuesta es 78 mililitros. El volumen final está compuesto por el volumen de tampón y el volumen de anticuerpo; por tanto, si dos con seis el volumen final, el volumen se desea que tenéis que añadir; uno con 82, añadirle 78 tener ya dos con seis litros de la anticuerpo de detección para preparar la mezcla, que lleva sustrato y sustrato, como la enzima, de la penosidad, sustratos. El peróxido de hidrógeno y homogéneo es la 1, dos feliz ni a Mina, que es el que tiene color amarillo naranja cuando se oxiden este sustrato homogéneo; viene en pastillas. En comprimidos que pesan 20 miligramos mililitros como ya explicamos en la introducción, lo que nos pide; la práctica es calcular o preparar el cromosoma nacer o cinco miligramos -mililitros y por tanto necesitamos saber qué volumen de disolvente tenemos que añadir para prepararlo. Se le sustituye la fórmula -concentración más polvo, uno menos y por tanto, tenemos la respuesta al volumen final total que necesitamos para diluir ese comprimido serían 40 mililitros; si no hubiera otro susto; si no hubiera otra molécula más, se haría directamente, pero necesitamos el sustrato de la reacción, que es el peróxido de hidrógeno. Por tanto, en este volumen final van a participar, el trato que se diluye y el volumen que va a ocupar el peróxido de hidrógeno vale. Esto está en polvo; tenemos que tener en cuenta la masa, pero el peróxido de hidrógeno ya viene disuelto; diluida en agua y, por tanto, tenemos un valor de concentración para calcular qué volumen necesitamos, pues aplicamos nuevamente la fórmula. La concentración original es tres por 100. Volumen, volumen. El volumen inicial es lo que queremos saber. Cuánto volumen tiene que coger de hidrógeno para preparar un volumen final de 40 ml que este dato lo calculado a partir de la dos fines de Amina y la concentración final que me piden es cero puntos a 5, porcentaje; volumen, monumento, es un dato de concentración, es una unidad de medida de concentración. Solo tenéis que sustituir despejar la fórmula y obtener que el volumen de peróxido de la disolución de hidrógeno, que necesitáis es como a seis 7.000 litros. Entonces, en el volumen final, que son 40 mililitros pero 6, 6, siete mililitros son de la disolución de hidrógeno por tanto restantes y el volumen restante hasta 40. Es decir, 39 contactos, 33 de volumen de trato, en la práctica, si os dice que los comprimidos, no aportan volumen para que no tienes que tener que tenerlo en cuenta. Una vez que tenemos todo el proceso experimental realizado la reacción, se detiene con ácido sulfúrico y tenemos está en los pozos con este color amarillo anaranjado donde hay producto y se introduce en el espectro fotómetro. En este caso es un lector de placa de lista para que mida lapso a 400 no aumenta nanómetros en cada uno de los. Cuando el aparato mide. Nos da 1. Nos imprime podemos imprimir un papel. No nos salen en pantalla la lectura de cada uno de ellos solamente os represento la lectura de los que tienen volumen. El resto sería hacer. Entonces lo que tenemos que hacer es con estos datos que aparecen en la práctica no obtener ese anexo uno el ejemplo de el resultado. Que se obtendría de este ensayo pues tenéis que localizar e identificar el valor de de cada uno de los pasillos. Os acordáis? Teníamos marcado en los grupos de 3. La recta patrón está marcada en rojo de los de la f uno dos porque iban por duplicado el alumno; uno aparecen azul el dos en verde y el tres en rosas y que lo que hacemos es. Marcarnos para saber a quién. Corresponde cada uno de esos valores; a continuación, rellenamos la tabla que nos plantea la práctica colocando, identificando cada uno de los valores con el pozo que corresponde. Vale. Pasamos los datos a la tabla y ahora lo que hacemos son los cálculos de las media neta que necesitamos para poder hacer la representación gráfica. Entonces El Pozo y yo. F 1. F dos son los valores del blanco, y para realizar los cálculos con las organzas media neta necesitamos saber las media del blanco y restarse al resto de ellos. Así que se hace el cálculo. Por tanto, el blanco. La concentración cero de inmunoglobulinas equivale a la solvencia de cobro. Entonces estos son los datos con los que tenemos que trabajar media neta con los datos de la recta, de la hemoglobina concentración conocida. Se va a dibujar los datos de la gráfica y cuando se tengan entonces vamos a llevar nuestros datos problema para calcular a qué concentración equivale a ese valor de entonces. Cogemos los datos de la muestra patrón, los tenemos aquí las canciones tenemos aquí nuestra gráfica. Acordaron concentración y lineal las como comentaban -los valores de los. Podéis dibujar en la escalada siempre lineal, pero la separación como queráis, los que debéis hacerlo gráfica, lo más ancha posible, que no nos todos los datos en la parte de abajo. Entonces, uno de los un ejemplo de cómo ha distribuido esto, podía llegar a 1. Cada uno puede hacer con lo que quiera, siempre y cuando se respeten los valores y la genialidad. Vale, en este caso yo aquí dibujado que el máximo ser 8. Por tanto, la mitad sería 0. 4, por tanto, a la mitad serían cerdos. Estos serían los valores de estos puntos y una vez que los tengo pues cálculo. La distancia que hay entre esta estrella este y entonces poco los datos de lo primero es poner mi escala, determinar el máximo y poner los datos, bien puestos, haciendo los cálculos bien para que la representación sea correcta y después lo que hacemos es proceder a ir poniendo cada uno de los datos sobre la gráfica. Bien, pues empezamos por el valor cero nanogramos mililitros la solvencia que tienen es de cero uno uno cuatro vale pues buscamos el valor lo pintamos vale este punto es el valor de uno Tiene una observancia de cero con 198, pues aquí tenemos el 1, nos vamos a hacer realmente y 8, se dibuja en otro punto el de 10, es decir, y el tenis. Vale? Pues ya tenemos cada uno de los puntos y unimos un trazo sobre cada uno de esos puntos y obtenemos una curva, se donde hay al principio de la concentración no es suficiente para que sea proporcional. Llega un momento que la cantidad de Igea empieza a tener un producto de color que empieza a ser proporcional. Hay una parte lineal en donde conforme se aumenta la concentración, aumenta el color, el producto, las organzas y llega un momento que se satura. Ya no hay más encima y, por más que añadamos sustrato, no va a haber más producto, vale? En esta parte, la línea ya está saturada y hace como una muy bueno pues ya tenemos nuestra gráfica dibujada. Ahora necesitamos una vez que hemos visto cuál es la parte lineal, hacer la recta trazar la recta de calibrado y determinar los límites de sensibilidad de nuestro ensayo. Bien, pues esto es la zona lineal y, por tanto, ajustamos una recta a los tres puntos, en este caso que los he dibujado, un poco que separaba la recta. En este caso no hay encima ninguno de los tres pero deja aproximadamente izquierda a derecha. La misma distancia ésta sería nuestra recta de calibrado, y la rango de detención de este ensayo sería los valores, dentro de los cuales somos capaces de dar un valor de concentración con exactitud, es decir, que en el rango entre dos seis todos los valores de entren en este rango van a caer en la zona lineal y, por tanto, para esa vamos a poder dar un valor de concentración esa es mi rango de sensibilidad y yo puedo medir de uno hacienda mililitros y el rango de sensibilidad; observancia sería desde cero 98 acero, con 5, 8, ocho por encima de ese valor o por debajo de ese valor no podemos dar un dato de concentración con esa actitud vale, podríamos decir que es menor que mi rango de sensibilidad. Si es por debajo de 0, dos menor de un nanogramos mililitros y si está por encima los valores que estén por encima de su hermano, de 5, 8, ocho no podemos dar el dato con esta actitud, pero podemos decir que son mayores de el límite superior, que es bueno. Una vez que tenemos nuestra gráfica dibujada, la recta de calibrado, calculada y los rangos de sensibilidad del ensayo determinados. Pasamos a calcular la concentración de nuestra muestra, la tabla. Tenemos los valores de neta de cada uno de los y lo que hacemos es dibujarlo; en primer lugar, alumno, uno saliva a una dilución unos 50 es cero con cinco uno tres ocho buscamos el valor en la gráfica y extrapolar, los llevamos a la a dónde corta la recta de calibrado, y vemos en qué punto corta. En el eje de las equis, un error frecuente como sabéis, esto es, si esto es bueno, yo estoy 10. El siguiente número es el 2, 3, 4, si estos 10 estos tienen. El siguiente número es 20, 30, 40. Por tanto, el punto de corte en el eje para el primer para nuestra primera muestra sería, pues entre 30 40, los 38 nanogramos mililitro el alumno 1, la muestra que está diluida a 1.500. El valor de fiestero con cero 4, 1, 8, por tanto está por debajo, estaría por debajo del rango de sensibilidad. No podemos dar un dato exacto, pero podemos decir que es menor de nuestro límite inferior es un menor para el 1, dos haríamos lo mismo a una concentración, unos 50, se sale de nuestro rango de función detección. Por tanto podemos decir que es mayor de 100 mililitros pero no podemos dar su valor con exactitud cuándo vamos a las dilución 1.500, si entran rango cero 5, vemos en qué punto corta la recta y calculamos la concentración, que es aproximadamente veintiseis nanogramos por litro. Para el 1, tres ocurre lo mismo, está saturado, el uno 50 se sale de escala por la parte de arriba, con lo cual mayor de 100 mililitros y para la 50 a vamos hasta la recta de calibrado. Y vemos a qué datos de concentración corresponde el número y que se corta. El eje es aproximadamente tres con ocho nanogramos mililitros bien, pues ya tenemos los valores de concentración en los pasillos, y lo que tenemos que hacer ahora es calcular la concentración en la saliva del estudiante, vale no en el pozo y yo sino en la saliva original. Si se acordar es para preparar esta dilución es. Partimos de la saliva original, hicimos una dilución, unos 51.500. Vale para para calcular esa concentración tengo que tener en cuenta el factor de dilución. Entonces en el uno 1, el de unos 50 tiene 38.000 nanogramos mililitro. Por tanto, en la saliva de es estudiante tenemos ese valor que aparece, en el multiplicado por el factor de dilución que hicimos valer. En este caso de aquí aquí tuvimos 50 veces. Si yo tengo el dato de concentración, aquí se multiplica por 50 para saber la concentración. En este caso sería. 1900. Nanogramos por litro en la tabla que os dan. Os piden la concentración en microgramos. Mililitro único que tienes que hacer es convertir las unidades 1900. Nanogramos mililitros son uno con nueve microgramos -mililitros para el estudiante 2, la saliva del alumno; 2, tenemos la dilución, 1.500; tenemos veintiseis nanogramos 1.000 litros, por tanto, en la muestra original tendremos veintiseis 1.539 1.000 nanogramos mililitros por tanto 39 microgramos por mililitro; en el alumno; tres se hace la misma operación y el resultado son 5.700 nanogramos mililitros que son cinco con siete microgramos mililitros en el caso de la dilución, es 1.500 del alumno; uno en ese es menor de un y la saliva es menor que ese valor multiplicado por 1.500 vale, sería menos de 1.500. En el alumno; dos sería mayor de 5.000 sería mayor de 5.000. Hay otras cuestiones que puede que os haya tocado o no en relación a Al -al que hayáis hecho preguntas que se pueden hacer como que ocurre cuando los volúmenes de anticuerpo y captura son diferentes. Cuáles serían los resultados previstos? Qué ocurre si no se hace el primer lavado, si nos hace el segundo lavado o si no se hace el tercer lavado, cuáles serían los resultados o qué ocurre si hay diferencias en el volumen de las muestras o en el volumen de la de del patrón o bien de sustrato para todas esas posibilidades, que además son a veces errores reales de la práctica experimental tenéis que os puede preguntar. Cuáles serían las consecuencias cuando tenéis los valores de observancia, y a veces hay cosas que no cuadran? Pues tienes que saber dónde ha estado el fallo, en que pasó. Os podéis haber equivocado y cuáles serían las consecuencias? De acuerdo? Bueno, con esto terminamos, damos por resuelta la práctica y lo mismo cualquier duda a mi correo María, me punta.

Intervienen

Mª Concepcion Martinez-esparza Alvargonzalez

Propietarios

Mª Concepcion Martinez-esparza Alvargonzalez

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Serie: Docencia en Inmunología (+información)

Descripción

Material docente teórico y práctico de la asignatura Inmunología